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"Étude du rôle de la protéine X du virus de l’hépatite B dans la réplication virale et la carcinogenèse hépatique" par Christine Neuveut

Discipline: Biochimie et Biologie Moléculaire

Résumé
L’infection chronique par le virus de l’hépatite B représente un facteur de risque majeur pour le développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, les mécanismes moléculaires responsables du CHC restent mal compris. la protéine virale HBx agit comme un cofacteur dans ce processus, soit indirectement en activant la réplication virale soit plus directement en modulant de nombreuses fonctions cellulaires. La thématique principale de mon groupe est l’étude des mécanismes moléculaires gouvernant les activités d’HBx et leur rôle sur la réplication virale et l’oncogenèse afin de définir pour l’avenir de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons d’abord étudié l'activité transactivatrice d'HBx dans le cadre de son interaction avec CREB, un facteur important pour le métabolisme, la prolifération et la transformation hépatiques. Nous avons découvert qu’HBx interagit avec les co-activateurs CBP/P300 et augmente in vivo leur recrutement sur des promoteurs cellulaires cibles de CREB, un mécanisme qui corrèle avec l’activation transcriptionelle de ces gènes. Nous avons par la suite étudié le rôle de CREB et d’HBx dans la régulation transcriptionnelle de l’ADN viral (ADNccc). Nous avons alors montré qu’HBx interagit avec les protéines du complexe PP1/HDAC1 et inhibe l’activité phosphatase de PP1, ce qui a pour conséquence de prolonger la phosphorylation et l’activité de CREB liée à l’ADNccc, et d’augmenter ainsi la transcription virale. Ces études renforcent la notion qu’HBx, via un réseau complexe d’interactions avec des régulateurs transcriptionnels, module la régulation épigénétique et transcriptionnelle de l’HBV et de gènes cellulaires. Nous avons confirmé le rôle d’HBx dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique de l’ADNccc dans des hépatocytes humains primaires ou des cellules HepaRG infectées par des virus sauvages ou n’exprimant plus HBx (HBV X-). Nos résultats montrent que l’ADNccc du virus HBV X- est faiblement transcrit et est associé à des marques répressives de la chromatine avec le recrutement du facteur répresseur HP1, confirmant qu’HBx joue un rôle clé dans la régulation épigénétique de l’ADNccc au cours de l’infection. Nous étudions actuellement les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place de cette répression.
En parallèle, par une approche de purification par affinité, nous avons isolé à partir d’extraits nucléaires de cellules HepG2 des partenaires d’HBx. En plus d’interactants connus d’HBx comme Cul4A et DDB1, nous avons identifié la protéine méthyltransférase PRMT1 et Spindlin1. Après avoir validé ces interactions par immunoprécipitation, nous avons montré que PRMT1 est recrutée sur l’ADNccc et inhibe sa transcription via son activité méthyltransférase. HBx est cependant capable de contrecarrer cette répression en inhibant l’activité enzymatique de PRMT1. Nous avons montré dans un modèle d’infection de cellules HepaRG que Spindlin1 est un régulateur négatif de la réplication/transcription de l’HBV. Nous étudions actuellement les mécanismes mis en jeu et recherchons si Spindlin1 est capable d’induire un remodelage de la chromatine.
Notre projet est de poursuivre l’étude du rôle d’HBx, notamment à travers son interaction avec les protéines cellulaires impliquées dans son activité transcriptionnelle et dans la réplication virale que sont DDB1, composant de l’E3 ubiquitine ligase DDB1/Cul4A et le complexe PP1/HDAC1. Enfin nous poursuivrons l’étude du rôle d’HBx dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique de l’ADN viral dans un modèle d’infection d’hépatocytes humains primaires et de cellules HepaRG. Nous déterminerons quels sont les mécanismes impliqués dans la répression transcriptionnelle de l’HBV et comment HBx contrecarre cette réponse. Ces études permettront non seulement de développer des inhibiteurs de la réplication virale et de l’oncogenèse liée à l’infection par l’HBV, mais aussi de découvrir de nouvelles voies de l’oncogenèse.

Abstract
The hepatitis B virus (HBV) is a small DNA virus that induces acute and chronic liver diseases, and represents a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma (HCC). To date however, the molecular mechanisms underlying HBV-associated carcinogenesis remain poorly understood. The HBV-encoded HBx protein is a regulatory protein that is essential for virus replication in vivo and is involved in the process of hepatocarcinogenesis. Our main interest is to study the key molecular mechanisms involved in HBx activity, including its role in the regulation of HBV replication as well as oncogenesis. To this aim, we first focused on the role of CREB in HBx transcriptional activity. The CREB/ATF protein family plays an important role in cell proliferation and liver functions. We first demonstrated that HBx interacts and cooperates with CBP/p300 in CREB/ATF-dependent transcription. We showed that HBx is associated with the promoters of CREB cellular target genes in vivo, which favors the recruitment of CBP/p300, resulting in transcriptional activation of the genes. We next studied the role of CREB in the transcriptional activation of HBV by HBX. We showed that when CREB is bound to the cccDNA, HBx sustains its phosphorylation and thus its activation through the inhibition of phosphatase protein 1 (PP1). We demonstrated that HBx acts via its interaction with a protein complex containing PP1 and HDAC1. All together these data suggest that HBx modulates transcription through the assembly and activation of enhancer-transcription factors and the modulation of chromatin remodeling. Importantly, we next assessed the role of HBx on virus transcription in the setting of HBV infection. We confirmed that HBx is required for HBV transcription and showed that infection by a virus defective for HBx resulted in the repression of viral transcription associated with the occurrence of repressive chromatin marks on cccDNA (histones hypoacetylation, histone H3 lysine K9 methylation and lysine K4 demethylation) and recruitment of the HP1γ repressive protein. HBV cccDNA is thus regulated by repressive chromatin remodeling events that can be reverted by HBx. We are currently characterizing in more detail the cellular mechanism involved in HBV repression.
Concomitantly, in order to understand the key molecular mechanisms involved in the transcriptional activity of HBx, we have isolated HBX interacting proteins using tandem purification affinity. Beside known HBx partners such as DDB1 and Cul4A, we identified new HBx interacting proteins such as methyl transferase protein1 (PRMT1) and Spindlin 1. We have confirmed these interactions in vivo and we have shown that PRMT1 is recruited onto the cccDNA and inhibits HBV transcription via its methyltranferase activity. HBx is however able to counteracts PRMT1 function through the inhibition of its methytransferase activity. By silencing the expression of Spindlin1 in cells that support HBV infection, we also demonstrated that Spindlin1 inhibits HBV transcription/replication in the setting of HBV infection. We are currently studying the mechanisms involved in the repression of HBV transcription by spindlin1.
Our aims is to further clarify the role of HBx in virus replication and in oncogenesis by focusing on the role of two complexes: HBx associated with HDAC1/PP1 and the complex containing HBx and the E3 ubiquitin ligase subunit DDB1. Finally, to gain insight into the mechanisms of HBV DNA regulation in the setting of infection, we will analyze the cellular mechanisms responsible for the repression of HBV transcription and how HBx bypasses this transcriptional repression.


Informations complémentaires
Monsieur Jean-Michel Pawlotsky, Professeur des Universités-Praticien Hospitalier, Hôpital Henri Mondor- Rapporteur
Madame Rosemary Kiernan, Directrice de Recherche, Institut de Génétique, Montpellier – Rapporteur
Madame Dina Kremsdorf, Directrice de Recherche, CHU Necker, INSERM U845, Paris - Rapporteur
Madame Florence Margottin, Directrice de Recherche, Institut Cochin, INSERM U1016, Paris – Examinateur
Monsieur Marc Nadal, Professeur des Universités, Institut de Génétique et Microbiologie, Orsay- Examinateur

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