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"Etude structurale et fonctionnelle du facteur de transcription M2-1 du virus respiratoire syncytial" par Marie-Lise Blondot

Discipline: Virologie, Laboratoire: VIM - UR 892 - Unité de Virologie et d'Immunologie Moléculaires

Résumé :
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable de maladies respiratoires graves chez les jeunes enfants, causant à lui seul près de 70% des bronchiolites. Il n’existe pas de vaccin, et les antiviraux sont limités. Le VRS est un virus enveloppé dont le génome est constitué d’un ARN simple brin de polarité négative transcrit et répliqué par le complexe ARN polymérase dépendante de l’ARN (RdRP) viral. Ce complexe est composé de la nucléoprotéine N, de la protéine L, de la phosphoprotéine P et du facteur de transcription M2-1 qui assure la processivité de la polymérase au cours de la transcription virale. Le complexe RdRP constitue une cible idéale pour le développement d’antiviraux. C’est pourquoi une meilleure connaissance de la structure et du fonctionnement de ces protéines virales est cruciale pour développer de telles molécules. Mon sujet de thèse portait sur l’étude structurale et fonctionnelle de la protéine M2-1. Ce travail visait à définir les interactions entre la protéine M2-1 et différents partenaires viraux et/ou cellulaires. Nous avons déterminé la structure tridimensionnelle du domaine core (résidus S58 à K177) de la protéine M2-1 par Résonance Magnétique Nucléaire. Le recouvrement partiel des surfaces d’interaction de la protéine P et l’ARN sur la protéine M2-1 permet d’expliquer la compétition observée précédemment entre ces deux partenaires. Le rôle fonctionnel de huit résidus a ensuite été validé à l’aide d’un miniréplicon. Des expériences in vitro ont montré que ces mutations affectaient soit l’interaction avec l’ARN soit l’interaction avec la protéine P. Ces observations ont été corroborées par des expériences d’immunofluorescence dans lesquelles le recrutement de la protéine M2-1 aux corps d’inclusion cytoplasmique, sites actifs supposés de synthèse de l’ARN viral, était inhibé par les mutations affectant spécifiquement l’interaction avec P. Ces expériences ont montré que les interactions avec l’ARN et la protéine P peuvent être découplées et sont toutes deux essentielles pour l’activité de la protéine M2-1. D’autres études concernant l’interaction entre M2-1 et M ont été initiées.

Mots clés : Virus Respiratoire Syncytial, ARN polymérase, transcription, phosphoprotéine P, Résonance Magnétique Nucléaire, structure tridimensionnelle, interaction, miniréplicon, corps d’inclusion.

Abstract:
Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the main cause of pneumonia and bronchiolitis in young children. There is no vaccine nor antiviral. This virus encodes its own RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex to transcribe viral genes and replicate its genome. RSV in an enveloped virus which genome consists of a single-stranded nonsegmented negative-sense RNA molecule. RSV replication and transcription depend on the RdRp complex composed of the nucleoprotein N, the phosphoprotein P, the large protein L and the transcription factor M2-1. Our aim is to characterize the structure and the function of the RSV RdRp proteins. This knowledge is essential to better understand how the virus replicates, and also to develop antiviral strategies. This work aimed to define M2-1 protein interactions with viral and/or cellular partners. The M2-1 protein functions as an essential transcription factor of the viral RdRp complex by increasing polymerase processivity. M2-1 is a modular RNA binding protein that also interacts with P. These binding properties are related to the core region of M2-1 encompassing residues S58 to K177. Here we report the Nuclear Magnetic Resonance structure of the M2-158-177 core domain. The partial overlap of RNA and P interaction surfaces on M2-158-177 rationalizes the previously observed competition between RNA and P for binding to M2-1. Using site-directed mutagenesis, we identified eight residues located on these surfaces that are critical for an efficient transcription activity of the RdRp complex. Single mutations of these residues disrupted specifically either P or RNA binding to M2-1 in vitro. M2-1 recruitment to cytoplasmic inclusion bodies, which are regarded as sites of viral RNA synthesis, was impaired by mutations affecting only binding to P, but not to RNA, suggesting that M2-1 is associated to the holonucleocapsid by interacting with P. These results reveal that RNA and P binding to M2-1 can be uncoupled and that both are critical for the transcriptional activation function of M2-1. Preliminary studies concerning M2-1-M interactions were also performed.

Keywords : Respiratory Syncytial Virus, RNA polymerase, transcription, phosphoprotein P, Nuclear Magnetic Resonance, tridimensional structure, interaction, minireplicon, inclusion bodies.

Informations complémentaires
Monsieur Denis Grelier, Directeur de Recherche, ENS, Lyon – Rapporteur
Monsieur Yves Gaudin, CNRS, Gif-sur-Yvette – Rapporteur
Madame Sonia Longhi, Chargée de recherche, Université d’Aix Marseille I et II, Marseille – Examinateur
Monsieur Jean-François Eleouet, Directeur de recherche, VIM-UR892- Unité de Virologie et d’immunologie moléculaires – Directeur de thèse
Monsieur Marc Nadal, Professeur des Universités, Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines – Examinateur

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